二、禽流感病毒h5亚型血凝抑制试验抗原与阴性、阳性血清

【主要成分】抗原为灭活的h5亚型禽流感病毒，血凝抑制效价≥7log2。阳性血清为spf鸡感染禽流感病毒h5亚型制备的高免血清，血凝抑制效价≥7log2。阴性血清为无特定病原鸡血清。

【物理性状】抗原为白色或淡黄色海绵状疏松团块，阳性血清和阴性血清为微黄色或淡红色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

【作用与用途】用于血凝抑制试验检测禽流感病毒h5亚型抗体。

【用法】

准备的材料：96孔v形（90度）微量反应板、单道及多道微量移液器（配有吸头）、加样槽、吸管、烧杯。

ph值7.2的0.01摩/升磷酸盐缓冲液的配制：1配制25倍磷酸盐缓冲液。称量2.74克磷酸氢二钠和0.79克磷酸二氢钠，加蒸馏水至100毫升。2配制1倍磷酸盐缓冲液。量取40毫升25倍磷酸盐缓冲液，加入8.5克氯化钠，加蒸馏水至1000毫升，用氢氧化钠或盐酸调ph值至7.2；69千帕高压蒸汽灭菌15分钟或用微孔滤膜过滤除菌。

磷酸盐缓冲液一经使用，于2c～8c条件下保存不超过3周。

阿氏（alsevers）液的配制：称量葡萄糖2.05克、柠檬酸钠0.8克、柠檬酸0.055克、氯化钠0.42克，加蒸馏水至100毫升，加热溶解后调ph值至6.1，69千帕高压蒸汽灭菌15分钟，置于2c～8c条件下保存备用。

1%鸡红细胞悬液的配制：采集2～3只spf公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡血液，与等体积阿氏液混合，用ph值7.2的0.01摩/升磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次洗涤后均以3000转/分离心5分钟，之后用磷酸盐缓冲液配成1%红细胞悬液，置于2c～8c条件下保存备用。

抗原溶解：冻干的抗原和血清均按瓶签上标注的量，用磷酸盐缓冲液溶解。

【血凝试验及结果判定】在v形微量反应板中，每孔加0.025毫升磷酸盐缓冲液。第一孔加0.025毫升抗原，反复抽打3～5次混匀。从第一孔吸取0.025毫升抗原加入第二孔，混匀后吸取0.025毫升加入第三孔，如此进行对倍稀释至第十一孔，从第十一孔吸取0.025毫升弃去。每孔加0.025毫升磷酸盐缓冲液和0.025毫升1%鸡红细胞悬液。将反应板在振荡器上震荡1～2分钟或轻扣反应板混合反应物，在室温（20c～25c）下静置20～30分钟或在2c～8c条件下静置45～60分钟。在对照孔红细胞显著呈纽扣状时判定结果。结果判定时将反应板倾斜60°，观察红细胞有无泪珠状流淌，完全无泪珠样流淌（100%凝集）的最高稀释倍数为血凝效价。

【血凝抑制试验及结果判定】根据血凝试验测定的效价，计算配制4个血凝单位（4hau）抗原。血凝效价除以4即为含4个血凝单位抗原的稀释倍数。例如，血凝效价为1∶256，则4个血凝单位抗原的稀释倍数应是1∶64（256除以4）。第一至第十一孔加入0.025毫升磷酸盐缓冲液，第十二孔加入0.05毫升磷酸盐缓冲液。第一孔加入0.025毫升血清，充分混匀后吸0.025毫升于第二孔，依次倍比稀释至第十孔，从第十孔吸取0.025毫升弃去。第一至第十一孔均加入0.025毫升4hau抗原，在室温（20c～25c）下静置30分钟或在2c～8c条件下静置50分钟。每孔加入0.025毫升1%鸡红细胞悬液，振荡混匀，在室温（20c～25c）下静置20～30分钟或在2c～8c条件下静置45～60分钟，对照红细胞将呈明显的纽扣状沉于孔底。

以完全抑制4hau抗原的最高血清稀释倍数判为该血清的血凝抑制效价。当阳性对照血清的血凝抑制效价与已知效价误差不超过1个滴度、阴性对照血清效价不高于21og2时，试验方可成立。被检血清血凝抑制效价≤31og2判为阴性；=41og2判为可疑（可疑样品应重检，重检效价≥41og2判为阳性，≤31og2判为阴性）；≥51og2判为阳性。

【注意事项】1影响血凝和血凝抑制试验的因素很多，应严格控制试验条件。每加一份试剂或样品后需更换吸头，同时应严格控制作用温度和时间。2准确配制红细胞悬液，使用时应随时振摇。3用ph值7～7.2的磷酸盐缓冲液作为稀释液。4抗原和阴性、阳性血清若有污染应废弃。5准确配制4hau抗原，使用前需进行滴定，滴定好的抗原应在2小时内用完。6抗原和血清按规定方法保存。冻干试剂应按规定的体积用磷酸盐缓冲液溶解，溶解后置于2c～8c条件下保存不得超过1个月，可分装成小包装，在-70c条件下冻存，随用随取，但切忌反复冻融。7鸭、鹅以及哺乳动物的血清一般需进行非特异性凝集和抑制素的处理。8同一亚型不同毒株的血凝抑制试验抗原，若抗原性存在差异，则检测同一血清的血凝抑制效价不同。9剩余的试剂及空瓶不能随意丢弃，须经加热或消毒灭菌后方可废弃。

【贮藏与有效期】血清在-15c以下条件下保存，有效期为24个月。抗原在4c条件下保存，有效期为12个月。