一、禽流感病毒h5亚型反转录⁃聚合酶链式反应检测试剂盒

【主要成分】变性液1瓶（6毫升），酚、氯仿、异戊醇混合液1瓶（6毫升），异丙醇1瓶（9毫升），75%乙醇2瓶（10毫升/瓶），焦碳酸二乙酯（depc）1管（500微升），2摩/升醋酸钠溶液（ph值4）1管（700微升），阳性对照1管（100微升），阴性对照1管（100微升），反转录⁃聚合酶链式反应体系22管（22.5微升/管），6倍上样缓冲液1管（100微升），扩增对照1管（30微升）。

【作用与用途】适用于可能感染h5亚型禽流感病毒的咽喉拭子、泄殖腔拭子、组织、鸡胚尿囊液以及细胞培养物中的h5亚型禽流感病毒rna。

【用法与判定】1取1.5毫升焦碳酸二乙酯处理过的离心管，加入待检样品100微升，加300微升变性液，继续加入30微升2摩/升醋酸钠（ph值4）。反复颠倒离心管4～5次，以混合均匀。2加入酚、氯仿、异戊醇混合液300微升，反复颠倒离心管3～5次，再摇晃10秒，在冰上静置15分钟。3在4c条件下，以12000转/分离心20分钟，吸取上清液置于另一个离心管中。4加入等体积的异丙醇，在-20c条件下静置10～15分钟，沉淀rna。5在4c条件下，以12000转/分离心10分钟。弃去上清液，加入75%冰乙醇，轻轻地反复颠倒离心管3～5次。6在4c条件下，以12000转/分离心5分钟，弃去上清液，用滤纸吸干管壁上的余液，真空抽干或者置于37c条件下烘干5～20分钟。7加入10毫升焦碳酸二乙酯溶解rna。8取2.5微升rna转移到反转录⁃聚合酶链式反应体系管中。9置于pcr仪中，循环参数为45c反转录45分钟，94c预变性2分钟，94c扩增30秒、52c扩增45秒、68c扩增45秒，共35个循环，最后68c延伸8分钟。10取5微升聚合酶链式反应产物，混合1微升上样缓冲液，1%琼脂糖凝胶电泳分析产物，以dna分子量marker为参考。

结果判定，同时出现372bp和229bp大小的扩增片段时，判定为h5亚型禽流感病毒阳性，只出现229bp片段判定为其他亚型a型流感病毒阳性，只出现372bp片段判定为h5亚型疑似，无条带者判定为阴性。

【注意事项】1本试剂盒的rna提取液应置于2c～8c条件下存放，反转录⁃聚合酶链式反应体系置应置于-20c以下条件下存放，且尽量不要反复冻融。2反转录⁃聚合酶链式反应体系，用前要先在冰上彻底溶化，并瞬时离心将液体甩至管底。3病料的处理很重要，现地采集的病料应先进行研磨，再按照每克重量加入1毫升磷酸盐缓冲液（pbs），混匀后按10{l-end}-1

～10{l-end}-2

比例稀释后用于rna的提取。棉拭子病料直接加入1毫升磷酸盐缓冲液，混合后取溶液用于rna的提取，不需要稀释。4rna的提取直接会影响到反转录⁃聚合酶链式反应的检查结果，需要特别注意提取过程的操作。5注意废弃物的无害化处理，可疑待检样品及其接触过的器材要消毒灭菌，防止实验室散毒；含有或沾有溴化乙锭（eb）的物品需要高温处理。注意防止操作过程中的环境污染，有条件的情况下可以使用独立房间分别进行各环节的操作，无条件时则应尽可能划分不同功能的工作区，并且电泳时要采用单独的移液器。6剩余的试剂及空瓶不能随意丢弃，须经加热或消毒灭菌后方可废弃。

【贮藏与有效期】rna提取试液应置于2c～8c条件下保存，反转录⁃聚合酶链式反应体系置于-20c以下条件下保存，有效期均为6个月。